葡萄β型液泡加工酶基因(vvβvpe)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

？液泡加工酶(vpe)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因，β型vpe是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因。本研究以黑比诺葡萄(vitisviniferacv.pinotnoir)花后8个不同时期胚珠的cdna混合样为模板，通过rt-pcr扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名vvβvpe,genbank登录号:kc136352)，开放阅读框1485bp。进一步将vvβvpe克隆到pgex-6p-1原核表达载体并转入大肠杆菌(escherichiacoli)bl21中，经iptg诱导，获得约81.3kd的包涵体融合蛋白gst-vvβvpe。将诱导条件优化后，在37℃、0.05mmol/liptg诱导5h后融合蛋白gst-vvβvpe的表达量最大，采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白，电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求。使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清，经westernblot检测，该抗血清(稀释到1∶10000)与gst-vvβvpe融合蛋白识别反应良好，获得的抗血清可用于以后的vvβvpe的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等，为进一步明确vvβvpe在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据。