内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgls)的克隆与表达及酶学特性分析

？β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中，为了探讨其功能，以内生解淀粉芽胞杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tb2菌株基因组为模板，克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bgls)。测序结果表明，该基因的orf全长732bp，编码一条243个氨基酸的蛋白，理论分子量约为27.33kd，等电点约为6.89，其orf序列已登录genbank(accessionno.eu368224)。blast同源性分析结果表明，该基因的orf序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciensfzb42，genbankaccessionno.cp000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%，氨基酸序列的一致性达97.1%。将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至puc18载体上，利用基因自身的启动子构建重组表达载体puc-bgls，并导入大肠杆菌(escherichiacoli)bl21菌株中表达。sds-page分析表明，bl21::puc-bgls菌株表达了27kd左右的蛋白；该酶的最适反应温度为55℃，在50℃以下保温60min后残余80%以上酶活；最适反应ph为6.2，在ph4.4~6.84℃保温30min残余85%以上的酶活；ca2+和fe2+可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性，而cu2+、zn2+、mg2+和mn2+对其活性具有显著的抑制作用。实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌tb2β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础。