基于易错pcr技术的中性内切葡聚糖酶基因的定向进化

？纤维素酶的工业应用一直受酶活性低，成本高的限制，为了提高中性内切葡聚糖酶的活性，本研究利用易错pcr技术对来自枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)c-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究，在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子。实验获得了最佳突变株b-15和b-28，其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍。序列分析表明：突变体b-15有6个碱基发生了突变，分别是a360g、t402a、a419t、t648a、a1208g和a1397t，导致4个氨基酸突变，分别是n134k、q140l、n403s和q466l；b-28只有1个碱基发生了突变，导致了398位lys突变为arg。通过swiss-model服务器模拟酶的三维结构,分析表明，b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角；b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠。同时，对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件，优化后的酶活分别达到4.542和5.136u/ml，是优化前的2.2和1.5倍。实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株，为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础，也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。