牛ha和flag标记h3f3b基因真核表达载体的构建及鉴定

？组蛋白变体h3.3是一种参与重编程的关键母源因子，在核移植操作后，卵母细胞中的组蛋白变体h3.3蛋白会将供体细胞中的组蛋白h3.3替换，从而打开染色质结构，促进重编程过程。这两种h3.3蛋白的氨基酸序列上没有差别，而且目前还没有特异性的h3.3抗体，为了研究这一替换过程，本实验采用添加标签的方法，构建了牛(bostaurus)h3.3蛋白的真核表达载体。h3f3b是编码这一蛋白的基因，实验通过pcr的方法获得了h3f3b的cds区全长，并添加标签，通过双酶切的方法将片段连接到真核表达载体pcdna3.1(+)上，构建了pcdna3.1(+)-ha-h3f3b和pcdna(+)-flag-h3f3b重组质粒。双酶切和测序结果显示，片段连接正确，测序结果与genbank一致。将该质粒转染293t细胞后，通过反转录pcr(reversetranscription-pcr,rt-pcr)和免疫荧光染色及免疫印迹(westernblot)等方法确定了重组质粒的表达和定位。反转录pcr检测表明，只有在转染重组质粒组才能检测到重组h3.3基因的表达；westernblot检测表明，只有在转染重组质粒组中才能检测到标签蛋白的表达；免疫荧光染色后发现融合蛋白可以正确的定位到细胞核中。本研究成功构建了两种携带标签的h3f3b表达载体，并且能正确表达，可为将来研究h3.3交换提供方便。这种添加标签的方法也可以用于其他母源蛋白对供体细胞中蛋白交换的研究。