用于四种主要作物转基因筛查检测的标准质粒分子的构建及应用

？标准质粒分子能够及时满足转基因生物安全监管需求，被较多地用作转基因标准材料的替代品。本研究通过分析全球商业化种植和国内环境释放的水稻(oryzasatival.)、玉米(zeamaysl.)、大豆(glycinemax)和油菜(brassicanapus)4种主要转基因作物的分子特征，选取常用的扩增性较好的蔗糖磷酸合酶基因(sucrosephosphatesynthase,sps)作为内标准基因和外源花椰菜花叶病毒35s启动子(promoterofcauliflowermosaicvirus35s,camv35s)、胭脂碱合成酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegene,tnos)、苏云金芽胞杆菌基因(bacillusthuringiensis,bt)、双丙氨酰磷抗性基因(biolaphosresistance,bar)、新霉素磷酸转移酶基因(neomycinphosphotransferase,nptⅱ)和潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycinbphosphotransferase,hpt)作为水稻转基因筛查靶标序列；选取淀粉合成酶基因(zssⅱb)作为内标准基因和外源camv35s、tnos、bar作为玉米转基因筛查靶标序列；选取凝集素前体蛋白基因(lectin)作为内标准基因和外源camv35s、tnos、胰蛋白酶抑制剂基因(cowpeatrypsininhibitorgene,cpti)、烯醇式丙酮基莽草酸磷酸合成酶基因(enolpyruvylshikimatephosphatesynthase,epsps)作为大豆转基因筛查靶标序列；选取高移动簇蛋白基因(highmobilegroupprotein,hmg)作为内标准基因和外源camv35s、玄参花叶病毒35s启动子(figwortmosaicvirus35s,fmv35s)、烟草绒毡层特异启动子(tobaccotapetumspecificpromoter,pta29)、胭脂碱合酶启动子(nopalinesynthasepromoter,p-nos)、tnos、35s终止子(terminator-35s,t-35s)、tl-dna基因7(g7)终止子作为油菜转基因筛查检测的目标序列。利用重叠pcr技术将这些筛查目标序列连接在一起，最终克隆到pmd-18t载体上，构建成4套共包含4个内标准基因和13个转基因外源基因的通用阳性质粒分子：pmd-maize、pmd-rape、pmd-rice和pmd-soybean。研究结果表明，所构建的阳性质粒分子对目前国内外4类(大豆、油菜、玉米和水稻)主要转基因作物筛查覆盖率理论上达到90%，而对我国批准进口的转基因作物的理论筛查覆盖率达100%。可满足转基因生物安全监管检测过程中对阳性物质的需求。