兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的动态变化

？本研究旨在探索生长因子三阶段诱导法体外诱导日本大耳白兔(lepusbrachyurus)骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)定向分化为功能性胰岛β细胞的可能性，并观察其动态变化。采用红细胞裂解法分离纯化兔bmscs，免疫细胞化学法鉴定表面抗原cd90、cd34、cd44的表达；采用生长因子三步法，将兔bmscs体外诱导为胰岛细胞，倒置显微镜下观察其形态学变化；双硫腙染色鉴定细胞团；rt-pcr检测胰岛细胞相关基因(pdx-1、insulin、nkx6.1)的表达；免疫细胞化学法检测特异性蛋白的表达；酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)检测细胞分泌胰岛素的情况。结果显示，分离纯化获得的bmscs呈旋涡状或放射状生长，细胞形态大小均一，cd90、cd44抗原阳性表达，cd34抗原阴性表达。第一阶段诱导末(3d)，细胞形态无明显变化，部分细胞变圆，双硫腙染色不着色，未检测到任何特异性基因的表达；诱导7d时，细胞逐渐融合形成团簇状，双硫腙染色细胞团呈棕红色，仅检测到pdx-1基因的表达，证实其为胰岛前体细胞；第二阶段诱导末(11d)，细胞簇数目增多，细胞边缘突起，检测到pdx-1、insulin的表达；第三阶段诱导末(19d)，细胞团状物与周围开始分离，形成团簇状胰岛样结构，双硫腙染色细胞呈红棕色，可检测到pdx-1、insulin、nkx6.1均表达；免疫细胞化学法检测诱导后细胞内胰岛素蛋白的表达情况，实验组细胞胞浆内出现大量棕黄色颗粒，结果呈阳性反应，对照组细胞胞浆内未出现棕黄色颗粒，结果呈阴性反应；elisa检测诱导后培养上清液中胰岛素含量结果显示，3d时诱导组与对照组相比差异不显著(p＞0.05)，7、11和19d差异均显著(p＜0.05)，表明分离纯化的兔骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成熟的具有功能性的胰岛细胞。本研究为糖尿病患者实现自体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病提供了基础资料。