基础型无启动子基因打靶载体pmcs-ien的构建及初步检测

？基因打靶是一项以dna同源重组为基础，在基因水平上进行定向可遗传性修饰的新型分子生物学技术。无启动子基因打靶技术的建立，对于提高基因定点整合效率以及外源基因的正确表达非常重要。本实验通过pcr技术对pires2-egfp中的neor基因片段进行扩增，并在其上下游增加bamhⅰ和bglⅱ的限制性酶切位点。将得到neor基因片段连接至载体pmd19-tsimplevector上，命名为pmd-neo。用bamhⅰ和bglⅱ对pmd-neo与pegfp-c1进行酶切，连接目的片段后获得中间质粒pegfp-neo。随后使用bsp1407ⅰ和sfiⅰ对pegfp-neo和pires2-egfp进行酶切、连接构成另一中间质粒pires-egfpneo。通过bamhⅰ与mluⅰ对pires-egfpneo和pmd-mcs进行酶切，连接目的片段后得到最终的基础型无启动子打靶载体pmcs-ien。将pgk启动子连入用于克隆上游同源臂的多克隆位点中，并转染hela细胞对载体进行检测。结果表明，基础型无启动子基因打靶载体上的筛选标记基因可以富集具有g418抗性且绿色荧光表达阳性的细胞克隆，具有较好的生物学活性。本研究为利用基因打靶技术制作转基因动物提供了比较便利、高效的方法策略。