5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)基因am79aroa的活性位点分析

？am79aroa(wo/2009/059485)基因是从草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我国自主知识产权的新型草甘膦抗性基因，具有重要应用价值。为进一步解析am79epsps蛋白的作用机制，本研究对此蛋白的活性位点进行了研究。进化树分析显示am79epsps属于ⅰ型epsps。序列比对结果表明am79epsps中第107位的丙氨酸(ala)，第114位的苯丙氨酸(phe)，第355位的ala和第356位的组氨酸(his)是特异的。采用重叠延伸pcr介导的核苷酸定点突变技术，对这些保守的氨基酸位点进行定点突变。将am79aroa及其突变基因转入大肠杆菌(escherichiacoli)aroa缺陷型菌株er2799中，并进行草甘膦抗性鉴定。结果显示，phe114、ala355和his356等氨基酸的突变，使am79epsps蛋白的草甘膦抗性降低，表明这些氨基酸位点对于维持am79epsps高抗草甘膦的能力是必需的。同源建模结果表明，这些保守氨基酸位点的突变，使am79epsps蛋白的结构发生变化，这可能是导致突变蛋白草甘膦抗性能力降低的原因。两个ⅰ型epsps(荧光假单杆菌(pseudomonasfluorescens)g2epsps和拟南芥(arabidopsisthaliana)epsps)对应氨基酸突变后，其草甘膦抗性没有明显变化，表明am79epsps中几个特异的氨基酸位点的功能在ⅰ型epsps中并不是保守的。本研究结果为解析am79epsps高抗草甘膦的作用机理及对am79epsps进行定向进化提供了理论依据。