rip3基因重组质粒构建及其表达对mcf7细胞死亡方式的影响

？【】目的构建rip3基因过表达重组质粒，建立稳定过表达rip3基因的乳腺癌细胞株，并证实融合蛋白在细胞内的表达、定位及对mcf7细胞死亡方式的影响。方法逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)检测4种乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中rip3mrna的表达。以正常乳腺上皮细胞mcf10acdna为模板，pcr扩增rip3基因cdna全长，将合成的rip3编码区序列，克隆入mcherry载体的n末端，构建重组质粒mcherry-rip3，对重组质粒进行酶切鉴定及dna测序。钙法转染293t细胞，收集病毒感染mcf7细胞，basticidin(4mg/l)维持筛选，构建稳定表达细胞株。westernblot、荧光显微镜等检测目的基因表达效率及蛋白定位。显微镜下观察tnf-α及zvad处理下mcherry-rip3-mcf7细胞的死亡形态及比例。结果rip3mrna在乳腺癌细胞中普遍低表达。rip3基因成功克隆入载体。过表达mcherry-rip3基因的mcf7细胞可见红色荧光蛋白表达，定位于胞质。western检测到目的基因rip3在转染细胞中为过表达。mcherry-rip3转染后增强mcf7细胞对tnf-α联合z-vad诱导的细胞坏死的敏感性。结论成功构建rip3基因过表达重组质粒，获得外源性rip3稳定过表达的乳腺癌mcf7细胞株，mcherry-rip3定位于胞质，并在tnf-α介导的程序性坏死中起作用。