水牛体细胞核移植方法的研究

？探讨电融合参数对水牛体细胞核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞，在含有5μg/ml细胞松弛素的操作液中进行去核，然后将经0.1mg/laphidicolin(apd)处理1d,再用0.5%fbs培养2～9d的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中，再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol/l离子霉素激活处理5min并在2mmol/l的6dmap中培养3h后，在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μl）培养7~9d，观察其卵裂和胚胎发育情况。当电融合的电场强度为1500v·μs/mm(电压100v/mm×脉时15μs)时,电脉冲3次，颗粒细胞核移植的融合率为74.18%，分裂率为71.82%，囊胚发育率为10%，融合率显著高于2次电脉冲(52.03%，p<0.05)，卵裂率显著高于4次电脉冲(53.95%，p<0.05)；当电脉冲次数为3次时，电场强度为2　000v·μs/mm的分裂率（53.54%）显著低于1500v·μs/mm，2500v·μs/mm的融合率（62.0%）和分裂率（53.23%）均显著低于1500v·μs/mm(p<0.05)。采用耳皮成纤维细胞作供核的融合率（59.75%）和分裂率（57.45%）均显著低于颗粒细胞。染色体组型分析显示，66.7%的核移植胚胎具有正常的供体细胞二倍体核型。将来自1头22岁的摩拉公牛耳皮成纤维细胞的2枚冻胚移植给受体母牛，妊娠到215d时发生流产。结果表明，高龄水牛的体细胞核移植胚胎能发育到妊娠晚期；水牛体细胞核移植的适宜电融合参数为100v/mm，15μs，3次电脉冲；颗粒细胞的电融合核移植效果优于耳皮成纤维细胞。