柔嫩艾美耳球虫cathepsinb基因的克隆表达及活性研究

？旨在利用同源克隆法从柔嫩艾美尔球虫(eimeriatenella)中克隆组织蛋白酶b基因（etcatb），为进一步研究其基因表达和基因功能奠定基础。选用未孢子化的柔嫩艾美耳球虫houghton株，通过对已公布的柔嫩艾美尔球虫序列进行分析，利用rt-pcr的方法克隆etcatb基因的cdna序列，并将其重组于transe1原核表达载体中，鉴定后，重组质粒转入大肠杆菌rosetta进行诱导表达。利用纯化所得etcatb蛋白制备兔抗多抗，同时利用明胶酶谱法初步验证其活性。利用real-timepcr和westernblot的方法检测etcatb在球虫发育不同阶段和孢子化不同阶段的表达水平。成功克隆得到一个长度为1539bp的etcatb基因，并重组表达了球虫的组织蛋白酶b。sds-page电泳结果显示，在1mmol？l-1iptg37℃诱导4h下，主要以包涵体的形式表达；4℃过夜诱导可以使之转为可溶性表达。表达产物在低ph、有还原剂存在的环境中，可以降解明胶，初步证明重组表达的酶具有一定的活性，etcatb在配子体和裂子体时期表达较高，未孢子化和子孢子阶段表达相对较低，孢子化过程中表达逐步增加。etcatb基因的克隆和表达研究，为进一步探究该基因在鸡球虫入侵及其他生物学功能中所起的作用提供了理论基础。