鸡囊胚细胞dmso细管冷冻保存技术研究

？旨在研究高效鸡囊胚细胞（blastodermalcells，bcs）冷冻保存技术，为利用bcs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素(fluoresceindiacetate，fda)染色以及培养24h后细胞贴壁率双重检测bcs活力方法，比较二甲基亚砜（dmso）不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对bcs的冷冻保存效果。结果表明：（1）dmso不同浓度，20%组解冻后活力最高（0.58），与15%组差异不显著（p>0.05），但与5%、10%和25%组差异极显著（p<0.01）；细胞复苏后贴壁率，20%组最高（30.5%），与15%组差异不显著（p>0.05），与25%组差异显著（p<0.05），与5%和10%组差异极显著（p<0.01）。（2）冷冻速率，使用三步法冷冻，以-1℃？min-1的速率降温至-7℃，保持10min，继续降温分别至-15、-35、-55、-75℃后，投入液氮中保存，-75℃组解冻后活力最高（0.53），但与-35℃、-55℃组差异不显著（p>0.05）；贴壁率，各组间差异极显著（p<0.01），其中-35℃组最高（36.6%）。（3）37℃水浴解冻，10s、1min、2min、3min解冻后，各组间活力差异不显著（p>0.05），其中10s组最高（0.60），解冻后贴壁率，37℃水浴1min组结果最好（43.9%），与水浴2min组差异不显著（p>0.05），但与水浴10s组差异显著（p<0.05），与水浴3min组差异极显著（p<0.01）。50℃水浴5s、20s、40s、1min解冻，5s组活力最高（0.70），与20s组差异显著（p<0.05），与40s、1min组差异极显著（p<0.01），解冻后贴壁率，各组间差异均极显著（p<0.01），其中50℃水浴5s组最高（36.9%），50℃水浴1min组最低（5.6%）。综上表明，鸡bcs使用dmso浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻，以-1℃？min-1的速率降温至-7℃保持10min，继续以此速率降温至-35℃后，投入液氮保存，37℃水浴1～2min解冻，bcs通过fda染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。