鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选

？本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白（zyxin）基因的rnai慢病毒载体，对其进行滴度测定，并进行有效干扰靶点的筛选，为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础。提取鸡胸腺组织的rna，反转录，扩增zyxin基因的编码区，并将其克隆到真核表达载体pex-6上。设计针对zyxin的shrna序列，应用基因重组技术插入到lv3慢病毒表达载体中，将lv3-shrna载体与包装质粒pgag/pol、prev、pvsv-g共转染293t细胞，进行病毒包装。将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度，分别转染293t细胞，进行滴度的测定。将构建好的4条慢病毒载体与pex-6-zyxin真核表达载体共转染293t细胞，运用rt-pcr和western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。构建4条针对目的基因zyxin的rnai慢病毒穿梭质粒表达载体co1、co2、co3、co4和1个阴性对照质粒，经测序鉴定正确；共转染293t细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×108tu·ml－1，适合感染目的细胞，经过筛选，co3对zyxin在293t细胞中的表达干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因rna干扰慢病毒表达载体，并进行了有效干扰靶点的筛选，为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。