秦川牛srebp1基因重组腺病毒载体的构建与病毒包装

？克隆秦川牛的srebp1基因并构建重组腺病毒表达载体，包装扩繁获得高滴度病毒，拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础。本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料，提取总rna并反转得到cdna，以genbank收录的牛的srebp1基因mrna序列设计引物，pcr扩增srebp1基因与克隆载体pmd19-tsimple连接并测序鉴定。挑选测序正确的srebp1基因酶切后连接到腺病毒穿梭载体上构建padtrack-cmv-srebp1表达载体，用pmeⅰ限制酶酶切线性化，然后转染到含有骨架载体padeasy-1的e.colibj5183感受态进行同源重组，得到腺病毒重组载体pad-srebp1。用pacⅰ限制酶酶切线性化pad-srebp1载体并回收质粒大片段，转染293a细胞包装病毒并扩繁提高病毒滴度，绿色荧光蛋白(gfp)标记法测定腺病毒的滴度。本试验成功克隆了秦川牛的srebp1基因，测序结果与genbank收录的牛的基因序列比较有2处位点突变，均已排除扩增酶的保真性不高等外界因素造成的。将srebp1基因与穿梭载体连接构建了padtrack-cmv-srebp1表达载体，并与骨架载体重组得到重组腺病毒载体pad-srebp1，用pacⅰ酶切线性化包装病毒，扩繁得到病毒滴度为1.5×109gfu·ml－1高滴度病毒。本研究成功克隆秦川牛srebp1基因并重组成病毒重组子，包装扩繁得到高滴度腺病毒。