基于gfp的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证

？旨在构建基于gfp报告基因的zfn真核细胞筛选体系，为zfn的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pegfp-n1为基础，去除egfp基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入atg，构建筛选体系的通用载体pegfp-atg。将zfn的靶序列插入到通用载体egfp基因上游，且使起始密码子和egfp基因处于不同orf中，构建筛选载体pegfp-728。将pegfp-728转入hela细胞中，g418筛选hela-728细胞系，转染zfn到hela-728，48h内通过观察荧光判断zfn是否有效，挑取荧光细胞进行pcr、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明，通用载体pegfp-atg和含靶序列的筛选载体pegfp-728序列完全正确；pegfp-728转入hela细胞中观察不到绿色荧光，说明靶序列插入后使egfp发生移框；转染靶序列对应的zfn到hela-728中，48h观察到荧光的表达，说明zfn有效；挑取6个荧光细胞单克隆，pcr、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏，更适用于动植物等真核细胞的zfn筛选，同时还可应用于talen和cas9的筛选。