寿光鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶adsl基因的表达与克隆化细胞株的筛选

？利用rtpcr与race方法检测寿光鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌8种组织腺苷酸琥珀酸裂解酶（adsl）基因mrna的差异表达水平，构建adsl基因融合表达载体pgexadsl，转化大肠杆菌bl21（de3）,筛选阳性克隆，iptg诱导表达，通过构建真核表达载体pegfpadsl，利用脂质体介导法转染寿光鸡成纤维细胞，并进行阳性细胞的克隆化筛选与检测。结果表明：adsl基因开放阅读框序列长为1455bp，编码485个氨基酸；5′端非转录调控区具有典型管家基因的特征，在邻近起始密码子－28bp处发生c→t突变，该突变使该位点变为核呼吸因子2（nrf2）结合位点；经sdspage电泳显示，pgexadsl重组融合蛋白在分子量约为805ku处有特异的蛋白条带出现，与预期分子量大小一致，等电点为679，纯化后用westernblot检测为寿光鸡adsl蛋白。pegfpadsl转染寿光鸡成纤维靶细胞后24、48和72h，转染率在264％～412％之间，绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中，随表达量的增加，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状，经药物筛选和克隆化培养，获得表达pegfpadsl融合蛋白的阳性克隆细胞株，经rtpcr扩增与westernblot检测确认adsl融合蛋白基因已经整合到寿光鸡成纤维细胞的基因组中，获得正常表达。研究结果为揭示我国优良地方鸡种的风味基因结构，研究其生物学功能奠定基础。