牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染ipr1基因

？为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体pegfp-sra-ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了ipr1基因转染。克隆ipr1基因和sr-a启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体pegfp-sra-ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.ml-1g418,筛选1周,300μg.ml-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行pcr检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经g418筛选获得稳定转染peg-fp-sra-ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经pcr检测在大约1500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。