内蒙古白绒山羊fgf5基因克隆及其靶向shrna表达载体的构建和鉴定

？旨在构建内蒙古白绒山羊成纤维细胞生长因子ⅴ（fibroblastgrowthfactor5，fgf5）基因shrna真核表达载体（prnat-shrna）。以内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞总rna为模板，pcr扩增fgf5基因。设计并合成3条fgf5基因的靶向shrna序列，分别插入prnat-u6.1/neo载体中，构建重组干扰质粒载体prnat-shrna1、prnat-shrna2和prnat-shrna3，用脂质体lipofectaminetm2000将各重组干扰质粒转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞，realtimepcr检测fgf5mrna表达量。结果表明：克隆获得813bp的目的基因，包含了完整的orf，编码270个氨基酸。核苷酸序列及推导的氨基酸序列与绵羊fgf5基因（nm_001246263.1）及氨基酸序列同源性均为99%。fgf5基因shrna重组质粒经测序鉴定证明构建成功。重组表达质粒转染绒山羊胎儿成纤维细胞48h后可见绿色荧光表达；prnat-shrna1组、prnat-shrna2组和prnat-shrna3组fgf5的mrna表达水平均低于干扰空载体对照组（p<0.01），prnat-shrna2对fgf5的表达具有最佳的抑制效应。综上表明，成功构建prnat-u6.1/neo-fgf5表达载体，为探讨fgf5在毛囊生长中的作用奠定了基础。