猪链球菌2型表面蛋白分支酸合成酶通过p38mapk和nf-κb通路促进tlr4依赖的炎性反应

？在大肠杆菌中表达与纯化猪链球菌表面蛋白分支酸合成酶，研究其对小鼠巨噬细胞raw264.7细胞分泌细胞因子的影响，并试图解释其分子机制。以sc19基因组为模板，pcr扩增aroc基因，构建表达质粒，转化到bl21（de3）中并诱导表达，所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在，以8mol？l-1尿素（含有50mmol？l-1tris，ph8.0）为变性剂，对构建于pet-28a（+）的猪链球菌aroc基因在大肠杆菌bl21中表达的包涵体进行变性、复性、纯化、去除lps以及除菌。以aroc蛋白体外刺激raw264.7细胞，共同孵育4h后用real-timepcr的方法分析il-1β、tnf-α的mrna转录量。用erk1/2、jnk、nf-κb和p38的抑制剂以及tlr2和tlr4的特异性抗体来解释其引起炎性反应的分子基础。结果显示成功对aroc蛋白进行了变性、复性及纯化，该蛋白具有刺激巨噬细胞表达细胞因子的能力，用nf-κb的抑制剂以及tlr4的特异性抗体预处理细胞后能明显降低aroc导致的il-1β、tnf-αmrna的转录，用p38的抑制剂预处理细胞后能明显降低aroc导致的tnf-αmrna的转录量。结果证明aroc在raw264.7中通过p38mapk和nf-κb通路促进tlr4依赖的炎性反应。