鹅胆固醇7α-羟化酶基因克隆及原核表达

？为进一步研究胆固醇7α-羟化酶(cyp7a1)在胆汁酸合成和胆固醇代谢过程中的调节机制，采用rt-pcr和race方法从鹅(anseranser)肝组织克隆cyp7a1基因全长cdna序列，亚克隆其cds区并构建原核表达载体pet-28a-cyp7α1。重组质粒在大肠杆菌bl21（de3）菌株中经iptg诱导表达。经his-bind纯化试剂盒纯化的his-cyp7a1免疫balb/c小鼠，制备小鼠抗鹅cyp7a1多克隆抗体，westernblotting验证his-cyp7a1免疫原性和抗体的特异性。序列分析结果表明，该蛋白与鸡、大鼠、人、短尾猊、小鼠的cyp7a1蛋白氨基酸序列同源性分别为93%、66%、67%、68%、66%。sds-page分析结果表明，重组蛋白his-cyp7a1得到正确高效表达，该his-cyp7a1分子质量约为59ku，经纯化获得高纯度重组his-cyp7a1蛋白。制备了小鼠抗鹅cyp7a1多克隆抗体，效价达1∶104。westernblotting检测表明，该蛋白能够被小鼠抗his抗体和小鼠抗cyp7a1抗体所识别，小鼠抗cyp7a1多克隆抗体具有较好的特异性。试验结果为进一步研究cyp7a1基因结构和cyp7a1在鹅肝脏脂类代谢中的作用提供了基础和技术手段。