靶向狂犬病病毒n基因shrna抑制狂犬病病毒复制的研究

？为探讨小干扰rna(sirna)对狂犬病病毒（rv）复制的干扰作用，以rvn基因为靶向目标，设计合成4对编码sirna的dna序列，然后分别连接到载体prnatu6.3hygro上，转染bhk细胞，在潮霉素b抗性压力下筛选出4个阳性细胞株（bhkn1、bhkn2、bhkn3和bhkn4）。用100tcid50cvs11毒分别感染24孔板内的上述细胞，利用realtimertpcr、半数细胞培养物感染量（tcid50）、直接免疫荧光和westernblot检测抑制效率。接毒后48h，在bhkn1、bhkn2、bhkn3、bhkn4细胞株中，realtimertpcr检测到各细胞株均在不同程度上抑制了rv的增殖，其中bhkn2、bhkn1抑制效率高，分别为99%、67.72%，而bhkn3、bhkn4仅为38.59%和11.33%，抑制效果较弱；tcid50检测病毒数量比空载体表达细胞毒价分别低24、96.2、2.14和1.1倍；直接免疫荧光检测表明，4株细胞中rv含量为病毒对照的31%、1%、54%、82%，即bhkn1、bhkn2对病毒的沉默作用较强；westernblot结果显示bhkn1、bhkn2细胞株中rvn蛋白条带明显减弱。4种检测结果均表明bhkn1和bhkn2能有效干扰rv的复制。本研究在细胞水平筛选出具有高效抑制rv复制的2个靶位点n489和n701，为rv的基因功能研究、抗病毒药物的开发奠定了基础。