昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

？为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞，本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞（mef）用丝裂霉素c处理后，分别按1×104、1×105、1×106·ml-1密度接种，以h-dmem+15%ksr+lif为培养液，观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(es细胞)生长的影响，并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(scf)、scf+胰岛素对昆明小鼠es细胞分离克隆的影响。结果显示，胚胎在密度为1×105·ml-1的饲养层上，f1代和f2代es细胞克隆形成率均显著高于其他2组(p<0.05)。囊胚的f2代es细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(p<0.05)，培养液中添加scf显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(p<0.05)，同时添加scf和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及f1、f2代es细胞克隆形成率。所分离的es细胞显示akp染色强阳性，oct-4、ssea-1的免疫荧光检测阳性，具有es细胞的特点。由此认为，发育至囊胚的胚胎在mef密度为1×105·ml-1上，培养液中同时添加scf和胰岛素更适合昆明小鼠es细胞的分离培养。