牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析

？本文旨在对牛气管抗菌肽（trachealantimicrobialpeptide，tap）基因进行原核表达，以及研究重组蛋白的抗菌活性，并分析tap在各组织的表达分布情况，为开展转tap基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用rt-pcr从荷斯坦奶牛气管扩增tap基因，分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性，人工合成牛tap基因，构建pet32a(+)-tap重组质粒；然后转化大肠杆菌bl21，iptg诱导表达并纯化。对表达蛋白进行sdspage、westernblot鉴定；在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛tap的体外抗菌活性，并用rt-pcr法分析牛各组织中tap表达情况。测序结果表明，扩增到114bp目的基因片段，可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。sdspage分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku，重组蛋白以可溶性方式存在，表达量占菌体总蛋白的52.1%。westernblot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μl-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。tap基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达，在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达，在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛tap基因，重组牛tap蛋白在大肠杆菌中实现高效表达，并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性，为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。