猪源口蹄疫病毒china99/s株基因组全长cdna的构建及其感染性鉴定

？提取猪源fmdvchina99/s组织样品总rna，利用设计的引物对，分段进行扩增，获得覆盖全基因组的4个重叠片段（a、b、c和e），然后用bsmbⅰ/xmaⅰ、xmaⅰ/bamhⅰ、bamhⅰ/notⅰ、hpaⅰ/kpnⅰ分别双酶切a、b、e、c，并纯化回收，依次定向克隆到带有聚合酶ⅰ的ppⅰcdna3.1（+）转录载体内，最终得到重组质粒ppⅰ-fmdvcdna3.1（+）；然后对该质粒进行序列测定。结果表明，china99/s株基因组全基因组序列长8116nt（含poly（c）和poly（a）片段），其中5′ncr长1064nt，蛋白编码区核苷酸序列为6318nt，编码1个由2106个氨基酸组成的聚合蛋白，3′ncr长93nt，其后是含有38个a碱基的poly（a）尾。其中5′ncr引入含41个c的poly（c）片段。将ppⅰfmdvcdna3.1（+）用脂质体转染法导入bhk21细胞，传代培养，可以观察到典型的fmdv致细胞病变效应。利用cpe、电镜、动物试验、rt-pcr和序列测定进行检测，结果表明，从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源fmdvchina99/s株重组病毒。