牛klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立

？为了克隆牛klf4基因并构建重组反转录病毒载体，得到稳定的产毒细胞株，本研究设计了带有酶切位点的一对引物，以接触抑制生长状态的mdbk细胞为材料，用rt-pcr方法克隆出牛klf4基因的开放阅读框序列，将之插入干细胞反转录病毒载体pmscvneo构成真核表达载体pmscv-klf4；采用脂质体法将pmscv-klf4转染包装细胞pt67，通过g418筛选得到稳定的产毒细胞株，电镜观察培养液上清中的病毒颗粒，同时病毒感染nih3t3细胞测定其病毒滴度。结果表明，本研究克隆的牛klf4基因开放阅读框序列与已发表序列（nm-001105385）比对有99.9%的高同源性；构建的重组载体质粒可正常包装，电镜下可观察到典型的病毒颗粒，筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107cfu·ml-1。本研究成功构建的真核表达载体pmscv-klf4和得到的产毒细胞株，为进一步开展有关牛ips细胞的研究奠定了基础。