水牛yy1基因克隆及其shrna片段的筛选

？本试验旨在克隆水牛阴阳因子1（yy1）基因，并筛选获得可有效抑制水牛yy1基因表达的shrna干扰片段。以水牛成纤维细胞cdna为模板，采用rt-pcr方法，扩增水牛yy1基因cds序列，将其连接插入到pmd18-t载体中，进行序列测序并分析。采用xhoi和ecori双酶切，将水牛yy1基因编码区定向克隆至pegfp-n1载体中，构建其真核表达载体pyy1-egfp-n1。设计2条靶向水牛yy1基因的shrna序列并构建其慢病毒表达载体，命名为psicor-gfp-yy1shrna1/2。以psicor-gfp和psicor-gfp-1864分别为空白对照和阴性对照质粒，采用脂质体转染方法，将yy1真核表达载体分别与2条shrna慢病毒表达载体共转染293t细胞，48h后观察绿色荧光蛋白egfp表达情况；72h收集共转染细胞样品，采用qrt-pcr和western-blot方法分析yy1基因的表达水平。结果表明，克隆得到1248bp的水牛yy1基因cds序列，其与牛yy1基因的同源性达99%。构建的水牛yy1基因真核表达载体pyy1-egfp-n1能在水牛胎儿成纤维细胞（bff）中瞬时表达。酶切分析及序列测定结果表明，所构建的shrna慢病毒表达载体psicor-gfp-yy1shrna1/2为阳性克隆。质粒共转染293t细胞48h后，可观察到绿色荧光蛋白egfp的表达。qrt-pcr结果显示，设计合成的2条shrna对水牛yy1基因的表达均有抑制效果，其中yy1shrna2的抑制效果（93.64%）显著高于yy1shrna1（50.77%）(p<0.05)，western-blot分析结果显示，2条shrna对yy1蛋白表达均有抑制效果。以上结果说明克隆得到水牛yy1基因编码区序列，并获得2条有效抑制其表达的shrna片段，为进一步阐明yy1基因在水牛早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础。