DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

［摘要］目的？构建DC-SIGN分子真核表达载体，获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法？？以pUNO-hDC-？SIGN1Aa质粒为模板，通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因，经过NotI和BamHI双酶切之后，将其克隆入真核表达载体pIRES-？neo，构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN，以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-？fectamine？？？TM？？？2000转染到BHK21细胞，通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选，建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系，？利用流式细胞仪、Westernblotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果？？双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入？真核表达载体pIRES-neo中，测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后，获得了稳定表？达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示，阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示，DC-？SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Westernblotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论？？成功构建了稳定、高效表达？DC-SIGN分子的BHK21细胞系，为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。