小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化

［摘要］目的？原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12，对表达产物进行鉴定和纯化，以研究Spink12的免疫避孕效果。？？方法？？提取小鼠附睾组织总RNA，RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列，以NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后，将其连入原核表达？载体pET28（a）;经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28（a）-Spink12，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞。融合蛋白经IPTG诱导？表达，产物经SDS-PAGE电泳和Westernblotting免疫印迹鉴定。用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋？白6×His-Spink12。结果？？酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28（a）-Spink12。重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经？IPTG诱导，SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12，与理论分子量相符。融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量？的23.5%。用抗His单克隆抗体进行Westernblotting免疫印迹鉴定，检测到同样大小的条带。经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×？His-Spink12，纯度达91.1%。结论？？成功表达并纯化了融合蛋白6×His-Spink12，为进一步研究Spink12的免疫避孕效果奠定了基础。