siRNA真核表达载体对大鼠耳蜗前体细胞Notch3基因表达的影响

[摘要]　目的　构建Notch3基因的siRNA真核表达载体，探讨其对大鼠耳蜗前体细胞中Notch3基因表达的影响。方法　机械分离并胰酶消化新生大鼠耳蜗感觉上皮，悬浮培养基培养耳蜗前体细胞。根据Notch3基因序列设计并合成2对siRNA，插入pSilencer4.1-CMVneo载体，进行酶切及测序鉴定。采用脂质体法向大鼠耳蜗前体细胞转染重组质粒，采用Realtime-PCR和Westernblotting法检测重组质粒对Notch3基因的干扰效果。结果　经前体细胞标记物Abcg2染色鉴定证实原代培养的细胞球为耳蜗前体细胞。酶切及测序鉴定证实成功构建了siRNA真核表达载体pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2。Real-timePCR和Westernblotting检测结果显示所构建的Notch3基因真核表达载体成功地干扰了目的基因的表达。与空白对照组比较，转染pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2的细胞Notch3mRNA和蛋白表达量均有明显减少，而转染空质粒的细胞与空白对照组比较无显著差异。结论　成功构建了大鼠Notch3基因的RNAi真核表达载体，该载体在大鼠耳蜗前体细胞中对Notch3基因的表达可发挥抑制作用。