小鼠DUSP13'-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

？？？目的　建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSP1)3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统，并对其进行功能鉴定。方法　提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA，以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP13'-UTR全长序列，酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游，获得重组载体LuDP，经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞，48h后检测双荧光素酶报告基因的表达。将含有小鼠DUSP13'-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中，获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL，将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共转染NIH3T3细胞，检测双荧光素酶的活性，分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响。结果　成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体。小鼠DUSP1mRNA3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍，P<0.01)；共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍，P<0.05)，共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍，P<0.05)。结论　成功构建了DUSP13'-UTR双荧光素酶报告基因表达系统，该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究。