肠上皮细胞RNA干扰Hsp70基因转染条件的研究

旨在研究肠上皮细胞(IEC-6)RNA干扰效率的转染条件,并对4对Hsp70干扰序列进行筛选,为进一步以RNA干扰(RNAi)技术研究Hsp70对胃肠道的保护功能以及介导信号通路的机理打下基础。以24孔培养板培养IEC-6细胞,利用阳离子脂质体转染FAM-siRNA片段进入IEC-6细胞,采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测FAM-siRNA和转染试剂Lipo-fectamine2000不同剂量比例对转染效率的影响,并进一步采用RT-PCR和Westernblotting方法对Hsp70干扰序列进行筛选。试验结果表明,采用脂质体转染法可获得较高的转染效率,其中以80nmol/LFAM-siRNA+1μLLipofectamine2000组的转染效率最高(85.77%)。针对4个不同靶位点,进行Hsp70基因干涉,结果表明,4个组中Hsp70mRNA的表达显著下降,其中ol-igo4组的基因表达极显著降低。Westernblotting的结果表明,oligo2、oligo3和oligo4组中的Hsp70蛋白表达极显著降低。最终确定80nmol/LFAM-siRNA+1μLLipofectamine2000为最佳转染条件,以oligo4(Hsp70的基因位点为3672-3692)为最佳RNA干扰靶基因。