CYP4F2真核荧光表达载体的构建及其对HK2细胞ACE表达水平的影响

旨在构建重组CYP4F2基因真核绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP-CYP4F2，并转染到人肾近曲小管上皮细胞HK2中表达，为研究CYP4F2在真核细胞中的功能提供一个有效的载体；对CYP4F2过表达对HK2细胞中血管紧张素转化酶（Angiotensinconvertingenzyme，ACE）表达的影响进行初步研究。从肝癌细胞HepG2中提取总RNA，反转录成cDNA模板，通过PCR扩增出CYP4F2目的片段，纯化后经限制性内切酶酶切，T4连接酶连接到pAcGFP1-C1载体上，转化E.coliDH5α宿主菌，获得阳性克隆；通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析，确认重组质粒完整正确；抽提重组质粒，转染HK2细胞株，荧光显微镜观察荧光蛋白表达，RT-qPCR和Westernblot检测CYP4F2在细胞中mRNA表达。RT-qPCR检测ACE的表达。结果显示，CYP4F2基因目的片段成功重组，获得的重组质粒，保持了目的片段的特异性和序列完整性。荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达；RT-qPCR和Westernblot证实CYP4F2基因在转染的细胞内表达增高。RT-qPCR结果显示，转染重组质粒后细胞ACE表达有所增高。成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP-CYP4F2，CYP4F2过表达会提高HK2细胞ACE的mRNA水平。