靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ（XT-Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil-1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT-PCR和Westernblot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT-PCR结果显示，WJ3显著抑制XT-ⅠmRNA的表达，抑制率为72.39%；Westernblot结果显示，WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。