7-脱氢胆固醇还原酶基因沉默对体外培养小鼠腭突融合的影响

目的通过RNA干扰抑制7-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr7）基因在培养腭突中的表达，研究Dhcr7基因对腭突融合的影响。方法根据C57BL/6J小鼠Dhcr7基因特异性的siRNA序列构建pAdTrack-CMV-siDhcr7，阳性克隆的pAdTrack-CMV-siDhcr7质粒进行体外重组，筛选出抗卡那霉素的重组腺病毒pAdEasy-1-siDhcr7质粒，酶切后制备腺病毒载体DNA转染胚胎腭突。取妊娠13.5d的小鼠胚胎腭突共30对随机分为3组，每组10对。正常对照组、空白腺病毒对照组和实验组均用不含胆固醇培养基培养腭突，其中空白腺病毒对照组加入空白腺病毒，实验组加入Dhcr7siRNA腺病毒。培养48h后固定腭突并提取Dhcr7mRNA和蛋白，采用扫描电子显微镜（SEM）观察腭突融合情况，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分析Dhcr7mRNA和蛋白的含量。结果SEM检测显示，正常对照组和空白腺病毒对照组在培养48h时两侧腭突融合，形成连续的上腭；而实验组几乎没有生长，两侧腭突之间有很宽的裂隙。RT-PCR和Westernblot检测显示，实验组Dhcr7mRNA和蛋白表达与正常对照组和空白腺病毒对照组相比均明显减少，其差异有统计学意义（P<0.05）。结论Dhcr7基因在腭突中的表达下调后，腭突融合失败，说明Dhcr7基因在腭突正常发育融合中起一定的作用。