利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

目的：获得人的全长Hiwi编码区基因，构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长；利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES-hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP，再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应，得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒，包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人Hiwi全长编码区基因克隆成功，经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中，在荧光显微镜下，可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒，其可在HEK293A细胞内表达。