Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白，探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0mmol？L-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况；利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白，利用GFP特异性抗体采用Westernblotting法分析洗脱液中的蛋白；激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果：0.5和1.0mmol？L-1IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异；低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高；Westernblotting分析，GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白，条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联；细胞穿膜实验，绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高，所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。