重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

　为了了解人过氧化氢酶在各种常见肿瘤细胞中的表达情况，构建人过氧化氢酶的原核表达载体，在大肠杆菌中表达、纯化人过氧化氢酶，并进行活性检测．我们通过常规分子克隆手段构建原核表达载体ｐＥＴ-１５ｂ-ｈＣＡＴ，将其转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ，经过ＩＰＴＧ诱导，表达产物经超声破碎后用Ｎｉ-ＮＴＡ柱进行亲和层析纯化，用试剂盒检测重组ｈＣＡＴ酶活性，然后检测其对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用．通过荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）测定ｈＣＡＴ基因在ＨＬＦ-１正常细胞与几种常见肿瘤细胞中的表达情况．本研究成功构建了ｐＥＴ-１５ｂ-ｈＣＡＴ的原核表达载体，ＳＤＳ-ＰＡＧＥ检测结果表明，ＩＰＴＧ诱导表达出一条分子质量约为59.7ｋｕ的目的蛋白，该蛋白主要以可溶的形式存在，活性检测表明经纯化得到的ｒｈＣＡＴ比活力为62.9Ｕ／ｍｇ，ｐＵＣ１９质粒氧化损伤保护实验显示ｒｈＣＡＴ对ＤＮＡ有一定的损伤保护作用．ｑＰＣＲ检测显示ｈＣＡＴ基因在Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＰＣ３、ＨｅＬａ、ＨＴ-１０８０、ＨｅｐＧ-２等肿瘤细胞中的表达量明显低于ＨＬＦ-１正常细胞．成功构建了人过氧化氢酶的原核表达载体，利用大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ获得了ｈＣＡＴ的可溶性表达，纯化的ｒｈＣＡＴ具有活性，ｈＣＡＴ基因在Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＰＣ３、ＨｅＬａ、ＨＴ-１０８０、ＨｅｐＧ-２等肿瘤细胞中的表达量明显低于ＨＬＦ-１正常细胞．这为后续功能研究及性质实验奠定了基础．