犬博卡病毒结构基因VP2多片段原核表达载体的构建及表达条件的优化

目的构建重组pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,对诱导表达条件进行优化,为下一步获得大量纯化的融合蛋白奠定基础。方法应用蛋白二级结构软件,设计合成MVC-VP2基因片段引物。用PCR法扩增不同长度的cDNA片段,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点分别将四个不同的片段插入到pGEX-4T-3中,构建四种原核表达重组质粒,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达条件(诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度)进行优化,并通过SDS-PAGE鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了四种原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,成功表达四种融合蛋白,优选出IPTG诱导终浓度为0.5mmol？L-1,诱导时间为12h,诱导温度为18℃。结论成功构建了原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,优化出最佳诱导条件,为下一步获得大量纯化的目的蛋白、制备VP2多克隆抗体奠定基础。