大黄鱼β-actin 抗体的制备与组织表达谱分析

为探讨大黄鱼(Larimichthyscrocea)β-actin基因(LcActb)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱,作者以大黄鱼肝脏为材料,扩增LcActb的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)。酶切、测序结果表明,pET32a-LcActb构建成功。将pET32a-LcActb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Westernblotting验证;原核表达结果表明,IPTG可诱导一个分子量约45ku的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.4mmol/LIPTG、200r/min诱导表达5h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗LcActb的多克隆抗体;用纯化的多抗进行Westernblotting的结果表明,获得了特异性的LcActb抗体;通过实时荧光定量RT-PCR检测大黄鱼多种组织mRNA的表达,其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Westernblotting分析,结果显示,LcActb在大黄鱼成体各组织中转录和翻译水平的表达差异均不显著,可做为研究大黄鱼成体组织中其他基因表达和翻译水平的内参标准。