藏猪兴奋性氨基酸转运载体EAAC1基因的克隆与原核表达

兴奋性氨基酸转运载体EAAC1是肠道内谷氨酸的主要载体。本研究根据人的基因编码区设计一对特异性引物,以藏猪空肠总RNA为模板,通过RT-PCR获得一长约1600bp的cDNA片段,T/A克隆后测序,并进行序列分析;将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建融合表达质粒,转化到E.coliBL21(DE3)中进行表达。测序结果显示,获得的cDNA全长为1575bp,编码524个氨基酸;EAAC1分子量为57kD,等电点为5.34,GenBank登录号为GQ375513;该蛋白质具有3个N-糖基化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点和1个cAMP/cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,含有7个跨膜结构域和一个信号肽序列;SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白质与预期蛋白质大小一致。上述结果为进一步研究EAAC1的功能及其调控奠定了基础。