实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

为了快速、准确定量多鳍鱼Shh基因在机体组织中的表达水平，根据笔者克隆的Shh基因序列，选择其高度保守区域设计一对引物，对多鳍鱼各组织提取mRNA，经RT-PCR扩增，产物纯化后与pGEM-T-easy连接，转化大肠杆菌DH5α。筛选后得到重组标准品质粒，对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，表明Shh基因保守区段已经成功克隆。将重组标准品质粒进行倍比稀释，然后以此为模板，进行荧光定量PCR，系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归方程为y=-0.32x+10.47，回归系数为1.00。构建Shh基因表达检测标准品质粒和标准曲线，建立检测多鳍鱼Shh基因荧光定量PCR方法，为进一步研究Shh基因在组织中的动态分布和研究多鳍鱼系统发育奠定了基础。