茶树咖啡碱合酶cDNA 在大肠杆菌中的表达

通过RTPCR法扩增出茶树咖啡碱合酶(TCS)cDNA编码区全序列,并将其克隆到表达载体pET32a(+)中,得到重组质粒pETTCS,在表达宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表达,产生相对分子质量约为62000的融合蛋白。该融合蛋白包括112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及370个氨基酸残基的茶树TCS蛋白。实验结果表明,随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白产量逐渐增加,表达蛋白总量最高可达到菌体总蛋白的3914%;在15、25和37℃3个不同的诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白,而且产生的总量及其可溶性部分所占比例均随诱导温度升高而增加;在菌体的各个部位中,融合蛋白主要在细胞质中以可溶的形式进行表达,有少量在外周质中表达或以包涵体形式在细胞质中表达。另外,体外酶促反应表明,表达的融合蛋白能催化可可碱甲基化生成咖啡碱,具有正常的生物学活性。