荧光标记寡核苷酸的反相离子对色谱分析

建立荧光标记寡核苷酸反相离子对色谱分析方法,优化了流动相醋酸三乙胺浓度(0～0.15mol/L),pH4.5～7.0和洗脱强度等色谱条件。对5-mer,10-mer和15-mer非标记和5′-羧基荧光素(5′FAM)标记寡核苷酸的保留进行比较分析,研究荧光标记寡核苷酸的保留机理,并分离TaqManTM探针等多种常用荧光标记寡核苷酸。结果显示,不同长度荧光标记寡核苷酸在0.01mol/L醋酸三乙胺,pH7.0的条件下获得最大分离。荧光标记寡核苷酸的保留与非标记寡核苷酸有明显差异,两者可完全分离。在一定长度范围内非标记寡核苷酸随长度的增加,保留时间增长;相反,荧光标记寡核苷酸的长度增加,保留时间减短。荧光染料疏水性对其标记的寡核苷酸在反相柱中的保留有较大影响,荧光染料疏水性越强,其标记寡核苷酸保留时间越长。但疏水性的影响程度随标记寡核苷酸长度增加而逐渐变小。