循环连续流动分析法测定辣根过氧化物酶的活性

基于H2O2-辣根过氧化物酶(HRP)-邻苯二胺(OPDA)催化反应体系,建立了测定游离及固定化HRP酶活性的循环连续流动分析法(CCFA)。CCFA实现了反应液、反应过程的循环连续检测。用CCFA法对酶催化反应条件进行研究,得到的最佳反应条件是:pH5.0,反应温度27℃,66.0μmol/LH2O2,2mg/LOPDA,缓冲液为0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;测定游离HRP的线性范围为0～10U/L,检出限为0.21U/L,RSD<1.03%。使用CCFA法测定了固定化HRP的活性,并对HRP酶促动力学进行了研究,得到的游离HRP的米氏常数为0.078mmol/L,最大反应速度为0.26mmol/L(min),催化常数为5.2×104min-1。CCFA法操作简便、准确度高、节省试剂、易于实现自动化。