焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计

利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增产物,考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响;以rs914232、rs671位点为例,对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序,考察了两者对测序结果的影响。结果表明,提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度,测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此,在设计PCR引物时,应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合,为焦磷酸测序提供高质量的测序模板;在进行定量测序时,还要综合考虑待测位点(SNP)两侧的序列,选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序,使测序结果更加准确。