重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定，并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析，以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源。方法将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞（humanrhabdomyosarcoma，RD)进行分离培养，采用EV、EV71、CoxA16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定，同时电镜观察病毒颗粒形态，将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增，扩增产物纯化后进行PCR测序。通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列，利用生物信息学软件对序列进行比对分析，绘制进化树。结果在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中，有7份观察到明显的细胞病变，通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性，而所有标本CoxA16特异性引物检测为阴性，EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒，同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞，为圆形无包膜病毒颗粒，证实所分离病毒为EV71。测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7409、7406nt和7404nt，其VP1氨基酸序列同源性达99％以上。Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China（GQ994990.1）、Chongqing-3-09-China（GQ994991.1）均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高，重庆毒株Chongqing1-09-China（GQ994989.1）与2005年台湾分离984polyprotein、1235polyprotein序列毒株同源性最高，进化分析表明属于C4基因亚型。结论新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征，与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源。