耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的　通过建立细菌双杂交技术，筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。　方法　利用PCR扩增，获得PBP2a蛋白转肽酶活性区（TPase）的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSAN315株基因组DNA，经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点，获得基因组DNA表达文库；将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选，获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物，对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析，确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。　结果　成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒，可表达PBP2aTPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSAN315株基因组文库覆盖率达9倍，满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌，利用细菌双杂交技术经3次筛选，共获得9个猎物克隆，其报告基因的活性均升高2倍以上，对9个猎物质粒进行了测序，信息学分析表明它们均来自于MRSAN315株基因组，插入片段最长者648bp,最短者334bp,9个插入片段中含14个编码基因，其中10个功能未知，1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶，2个编码染色体解离稳定（SMC）蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14~46个氨基酸组成。　结论　利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。