Pyk2/PI3K/NF-κB在心脏成纤维细胞表型转化及迁移中的作用

目的用短发夹RNA干扰技术选择性下调大鼠心脏成纤维细胞(cardiacfibroblasts，CFs)中富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(prolein-richtyrosinekinase2，Pyk2)的表达，检测Pyk2/PI3K/NF-κB在细胞表型转化及迁移的作用。方法利用Pyk2特异短发夹RNA质粒载体，转染血管紧张素Ⅱ刺激的原代培养大鼠心脏成纤维细胞。使用Transwell小室模型、体外划痕法检测细胞迁移变化，并结合免疫荧光观察α-平滑肌肌动蛋白表达变化。蛋白印迹法检测Pyk2和磷酸化磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)p85亚基的蛋白水平，EMSA检测核转录因子κB(NF-κB)活性。结果Transwell实验显示CFs跨膜细胞数随培养时间延长而上升，但Pyk2shRNA转染组在不同时相点跨膜细胞数较对照组均明显减少，在6h分别为[（19.1±6.1）和（30.8±8.6）,P<0.05]，在12h分别为[(37.7±12.4)和(53.6±11.3),P<0.05]，而在24h分别为[(78.9±18.5)和(102.3±21.7),P<0.01]。转染Pyk2shRNA后α-平滑肌肌动蛋白表达明显受抑制，绿色阳性染色细胞的比例下降，荧光强度减弱。体外划痕法显示Pyk2shRNA转染组细胞迁移距离明显下降，在24h分别为0.838mm和1.213mm(P<0.05)，在48h分别为1.626mm和2.049mm(P<0.01)。Pyk2shRNA转染组Pyk2和PI3Kp85表达的相对条带强度较对照组减弱（0.47vs0.61,P<0.05），磷酸化PI3Kp85表达水平也较对照组有明显降低（0.31vs0.42,P<0.05）。NF-κB平均光密度分别为2.17和3.59（P<0.05）。结论Pyk2/PI3K/NF-κB可能是促进CFs向肌成纤维细胞表型转化和介导细胞迁移的重要信号途径，Pyk2可能成为防治心脏纤维化的新靶点。