bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

目的利用bcl-x微基因（minigene）构建重要顺式作用元件B2G、CRCE2的突变微基因，建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法以构建成功的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板，利用反向PCR的方法，按碱基互补配对原则设计能让顺式元件B2G,CRCE2定点突变的引物，进行PCR反应。PCR反应结束后，用DpnⅠ对模板质粒DNA进行消化，然后使PCR产物发生自身环化反应。将环化产物转化入感受态DH5α，通过筛选并最后利用测序来鉴定所构建突变微基因成功与否。结果测序结果鉴定，所克隆的突变微基因序列碱基无一错误突变。并且在HL-60细胞中，RT-PCR实验表明bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响，pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）转染后RT-PCR电泳显示bcl-xS几乎消失，pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xL/bcl-xS为1.6。结论成功构建及应用人类凋亡相关基因bcl-x的突变微基因，顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失，CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。