Ascl2转录调控人结肠癌上皮细胞内CDX2基因表达的研究

目的探讨Ascl2对人结肠癌上皮细胞中CDX2基因的转录调控作用。方法预测CDX2启动子的转录因子结合位点，构建包含8个不同长度的CDX2近端启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别命名为pGL3-CDX2-C1-8；将各质粒分别转染到shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T细胞中，检测细胞中的双荧光素酶活性。采用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术，用Ascl2抗体免疫沉淀与CDX2启动子区DNA片段相结合的Ascl2，PCR扩增CDX2启动子的特异性序列。结果转录因子数据库预测到CDX2近端启动子区含多个E-box结合位点和潜在的Nkx-2、GATA-1、CdxA、Sox-5、SRY等顺式作用元件。双酶切及测序结果证实pGL3-CDX2-C1-8重组质粒插入片段序列均正确。重组质粒在shRNA-Ascl2/LS174T细胞中的荧光素酶活性明显高于shRNA-Ctr/LS174T细胞（P<0.01）。随着CDX2启动子片段的缩短，荧光素酶活性呈升高趋势。ChIP实验证实在CDX2近端启动子存在与Ascl2相结合的片段，在shRNA-Ascl2/LS174T细胞中，Ascl2与CDX2启动子区域中-841~-646、-291~-134、-7~+138片段结合的DNA片段明显少于对照shRNA-Ctr/LS174T细胞。结论Ascl2在结肠癌上皮细胞中可能通过与CDX2近端启动子的直接结合而达到转录阻遏CDX2基因表达的目的。